線粒體、溶酶體、外泌體的提取均屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或胞外囊泡的分離純化技術(shù)，因各自的結(jié)構(gòu)特性、存在環(huán)境差異，提取過(guò)程中需重點(diǎn)控制純度、完整性及活性(或功能性)，以下是三類物質(zhì)提取的核心注意事項(xiàng)：
 

　　線粒體提取注意事項(xiàng)
 

　　線粒體是胞內(nèi)雙層膜細(xì)胞器，提取核心是分離線粒體與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等成分，同時(shí)避免膜結(jié)構(gòu)破裂導(dǎo)致功能喪失。
 

　　樣品處理與前期準(zhǔn)備
 

　　全程低溫操作(0-4℃)，抑制線粒體酶活性喪失及結(jié)構(gòu)降解，所有試劑、離心管、研磨器材需提前冰上預(yù)冷。
 

　　樣品需新鮮：細(xì)胞或組織樣品采集后立即處理，避免常溫放置；組織樣品需在液氮中快速研磨成粉末，加入預(yù)冷的線粒體分離緩沖液(含蔗糖等滲透壓調(diào)節(jié)劑)，防止線粒體因滲透壓失衡破裂。
 

　　加入保護(hù)劑：在緩沖液中添加蛋白酶抑制劑(避免線粒體蛋白降解)和抗氧化劑(如谷胱甘肽，減少活性氧對(duì)線粒體的損傷)。
 

　　分離與純化過(guò)程
 

　　控制破碎強(qiáng)度：細(xì)胞破碎需采用溫和方式(如玻璃勻漿器手動(dòng)勻漿、低功率超聲)，避免過(guò)度破碎導(dǎo)致細(xì)胞核、溶酶體破裂污染，同時(shí)確保線粒體完整釋放。破碎后可通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察，確保大部分細(xì)胞破碎且線粒體形態(tài)正常。
 

　　梯度離心參數(shù)精準(zhǔn)：線粒體分離常用差速離心法，需嚴(yán)格控制離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間(如先低速離心去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞核，再高速離心收集線粒體沉淀)，后續(xù)可通過(guò)密度梯度離心(如蔗糖梯度、 Percoll 梯度)進(jìn)一步純化，去除細(xì)胞質(zhì)蛋白和其他細(xì)胞器污染。
 

　　避免反復(fù)凍融：收集的線粒體沉淀需用預(yù)冷的保存緩沖液重懸，短期 4℃保存(不超過(guò) 24 小時(shí))，長(zhǎng)期需分裝后 - 80℃凍存，禁止反復(fù)凍融破壞膜結(jié)構(gòu)。
 

　　純度與活性驗(yàn)證
 

　　純度檢測(cè)：通過(guò) Western Blot 檢測(cè)標(biāo)志物，線粒體陽(yáng)性標(biāo)志物(如細(xì)胞色素 c 氧化酶 IV、線粒體熱休克蛋白 60)，陰性標(biāo)志物(如核蛋白標(biāo)志物組蛋白 H3、細(xì)胞質(zhì)蛋白標(biāo)志物 GAPDH)，確保無(wú)明顯交叉污染。
 

　　活性驗(yàn)證：若需后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)，需檢測(cè)線粒體呼吸鏈酶活性或膜電位，確認(rèn)提取的線粒體保持生物學(xué)活性。
 

　　溶酶體提取注意事項(xiàng)
 

　　溶酶體是含酸性水解酶的單層膜細(xì)胞器，提取關(guān)鍵是維持其酸性環(huán)境和膜穩(wěn)定性，避免水解酶釋放導(dǎo)致自身降解及樣品污染。
 

　　樣品與試劑準(zhǔn)備
 

　　緩沖液選擇：使用含酸性調(diào)節(jié)劑(如檸檬酸 - 磷酸緩沖液，pH 4.5-5.5)和滲透壓穩(wěn)定劑(如甘露醇、蔗糖)的專用緩沖液，模擬溶酶體內(nèi)酸性環(huán)境，防止膜破裂。
 

　　抑制劑添加：除蛋白酶抑制劑外，需加入溶酶體酶抑制劑(如氟化鈉、焦磷酸鈉)，抑制溶酶體內(nèi)部水解酶活性，避免其釋放后降解其他蛋白或自身結(jié)構(gòu)。
 

　　樣品新鮮度：細(xì)胞或組織需即時(shí)處理，溶酶體對(duì)溫度敏感，常溫下易破裂，全程嚴(yán)格低溫操作。
 

　　分離純化關(guān)鍵步驟
 

　　溫和破碎細(xì)胞：采用手動(dòng)勻漿或低強(qiáng)度超聲破碎，避免高壓導(dǎo)致溶酶體膜破裂，破碎后盡快離心分離，減少水解酶暴露時(shí)間。
 

　　優(yōu)化離心方案：通過(guò)差速離心初步分離后，采用密度梯度離心(如蔗糖梯度離心，濃度梯度 15%-40%)純化，溶酶體因密度較高會(huì)處于特定梯度層，需精準(zhǔn)收集目標(biāo)層。
 

　　避免 pH 波動(dòng)：所有操作中避免緩沖液與堿性溶液接觸，防止 pH 升高破壞溶酶體膜穩(wěn)定性，收集的溶酶體沉淀需用酸性保存緩沖液重懸。
 

　　質(zhì)量驗(yàn)證與保存
 

　　純度檢測(cè)：檢測(cè)溶酶體標(biāo)志物(如酸性磷酸酶、組織蛋白酶 D)，排除線粒體、細(xì)胞核等雜質(zhì)污染。
 

　　保存條件：短期 4℃保存不超過(guò) 12 小時(shí)，長(zhǎng)期需分裝后 - 80℃凍存，且需加入足量酶抑制劑，解凍后盡快使用。
 

　　外泌體提取注意事項(xiàng)
 

　　外泌體是細(xì)胞分泌的納米級(jí)胞外囊泡(直徑 30-150nm)，提取核心是提高回收率，同時(shí)去除蛋白 aggregates、脂蛋白等雜質(zhì)。
 

　　樣品預(yù)處理
 

　　樣品選擇：常用細(xì)胞培養(yǎng)液、血清、血漿、尿液等，血清 / 血漿樣品需先去除凝血因子和細(xì)胞碎片(5000g 離心 10 分鐘)，避免干擾后續(xù)分離。
 

　　避免污染：所有器材需滅菌處理，細(xì)胞培養(yǎng)液需使用無(wú)外泌體血清(通過(guò)超速離心預(yù)處理去除血清中的外泌體)，防止外源囊泡污染。
 

　　提取方法與操作細(xì)節(jié)
 

　　方法適配：根據(jù)樣品類型選擇試劑盒(如聚合物沉淀法、超速離心法、免疫親和法)，聚合物沉淀法操作簡(jiǎn)便但純度較低，超速離心法純度高但對(duì)設(shè)備要求高，免疫親和法特異性強(qiáng)但產(chǎn)量較低。
 

　　超速離心參數(shù)：若采用超速離心法，需嚴(yán)格控制轉(zhuǎn)速和時(shí)間(如先 10000g 離心 30 分鐘去除大顆粒雜質(zhì)，再 100000-120000g 離心 70-90 分鐘收集外泌體沉淀)，離心過(guò)程中保持溫度 4℃，避免囊泡結(jié)構(gòu)破壞。
 

　　避免反復(fù)離心：多次高轉(zhuǎn)速離心可能導(dǎo)致外泌體破裂，沉淀重懸時(shí)需用預(yù)冷的 PBS 緩慢吹打，避免劇烈振蕩。
 

　　純度驗(yàn)證與保存
 

　　純度檢測(cè)：通過(guò)透射電鏡觀察外泌體典型杯狀結(jié)構(gòu)，納米顆粒追蹤分析(NTA)檢測(cè)粒徑分布，Western Blot 檢測(cè)外泌體標(biāo)志物(如 CD63、CD81、TSG101)。
 

　　保存條件：短期 4℃保存不超過(guò) 3 天，長(zhǎng)期需分裝后 - 80℃凍存，加入蛋白酶抑制劑，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致囊泡破裂和蛋白降解。
 

 

　　貝博生物BB-3603溶酶體提取試劑盒是??動(dòng)物樣本溶酶體提取的常用工具??，具有操作簡(jiǎn)便、活性保持好、適用范圍廣等特點(diǎn)，適合科研人員開展溶酶體相關(guān)研究。
 

　　溶酶體提取試劑盒特點(diǎn)??
 

　　??適用樣本廣泛??：
 

　　可用于??動(dòng)物細(xì)胞??(如培養(yǎng)細(xì)胞)、??實(shí)體軟/硬組織??(如腦、脊髓、肝臟、腎臟、肌肉等)的溶酶體提取。
 

　　??提取過(guò)程簡(jiǎn)便??：
 

　　采用??差速離心法??純化溶酶體，步驟包括細(xì)胞裂解、勻漿、分級(jí)離心(1000g→3000g→5000g→20000g)，無(wú)需復(fù)雜儀器。
 

　　??保持蛋白活性??：
 

　　試劑盒含??專用裂解液??(如試劑A、試劑B)及??蛋白酶抑制劑??，可有效防止溶酶體蛋白降解，提取的蛋白適用于Western Blotting、蛋白質(zhì)電泳等下游實(shí)驗(yàn)。
 

　　溶酶體提取試劑盒適用場(chǎng)景??
 

　　??溶酶體功能研究??：如溶酶體酶活性分析、溶酶體膜蛋白相互作用等；
 

　　??疾病機(jī)制研究??：溶酶體與癌癥、神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默病)、代謝疾病等的關(guān)聯(lián)研究；
 

　　??藥物研發(fā)??：評(píng)估藥物對(duì)溶酶體功能的影響(如溶酶體靶向藥物)。
 

　　溶酶體提取試劑盒使用建議??
 

　　??樣本處理??：
 

　　細(xì)胞樣本：需先收集細(xì)胞(1-2×10?個(gè))，用冷PBS洗滌2次；
 

　　組織樣本：需剪碎后用勻漿器勻漿。
 

　　??離心條件??：
 

　　嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書的離心速度(如20000g，4℃)和時(shí)間(如20min)操作，確保溶酶體充分沉淀。
 

　　??下游應(yīng)用??：
 

　　提取的溶酶體蛋白可用于??Western Blotting??(檢測(cè)溶酶體標(biāo)志物，如LAMP1)、??酶活性測(cè)定??(如酸性磷酸酶活性)等。