探針染色工作液配制：
根據(jù)樣本數(shù)量，用HBSS將BBoxiProbe® O06熒光染料1000-2000倍稀釋，配制成探針染色工作液。

探針標記
原位標記：僅適用于貼壁培養(yǎng)細胞。
1、 培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿準備細胞樣本。
2、 待細胞生長到合適豐度，去除細胞培養(yǎng)基，用PBS洗細胞一次。
3、 加入適量體積37℃預(yù)熱的含O06探針工作液。
4、 在37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)于生長狀態(tài)下避光孵育20分鐘～40分鐘（具體孵育時間需根據(jù)細胞類型而定，需預(yù)實驗優(yōu)化）。
5、 移除染色液，用PBS（pH7.4）洗滌細胞3次。以充分去除未進入細胞內(nèi)的O06探針。
6、 加入200 μL HBSS緩沖液。
7、 熒光酶標儀、熒光顯微鏡（含合適濾片）檢測。最大激發(fā)/發(fā)射波長為488 nm / 516 nm。

收集后標記：懸浮細胞或貼壁細胞消化處理
1. 離心，吸除上清培養(yǎng)基。
2. 用PBS洗細胞一次。
3. 細胞收集后重懸浮于稀釋好的37℃預(yù)熱的O06探針工作液中，細胞濃度為1*106-2*107/毫升。
4. 于生長狀態(tài)下37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20-30分鐘（具體時間需根據(jù)細胞類型而定，需預(yù)實驗優(yōu)化）。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。
5. 離心，吸除染色液，加入PBS（pH7.4）重懸細胞，洗滌3次。以充分去除未進入細胞內(nèi)的O06探針。
6. 用HBSS/PBS/無血清細胞培養(yǎng)基重懸細胞。
7. 用熒光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀檢測。
最大激發(fā)/發(fā)射波長為488 nm / 516 nm。

活性氧檢測：
1. 對于原位標記探針的樣品可以用熒光酶標儀檢測，或者用激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡，直接拍照分析（需要有相關(guān)的熒光強度分析軟件）。
2. 或收集細胞后標記探針然后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。
3. 對于收集細胞后標記探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接拍照分析也可以（需要有相關(guān)的熒光強度分析軟件）。
4. 使用488 nm激發(fā)波長，520 nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。
探針O06的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測。
5. 熒光強度強，活性氧含量高。