2-8℃避光

兩年

1.PBS 2.HBSS

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套

1.使用方法需自行參考相關文獻資料決定。請根據(jù)實驗安排或參考文獻使用。以下僅供參考。

根據(jù)需要使用。以下僅供參考。

1. Brdu儲存液的準備
用1X PBS充分溶解適量的Brdu配置10 mg/ml的母液，過濾除菌后，按照0.5ml/管的量分裝放在-20°C或者-80°C長期保存，避免反復凍融。Brdu儲存液再融化后，4°C可穩(wěn)定存放一周。

2. 體內(nèi)Brdu標記
1） 腹腔注射法（常用）：無菌的10 mg/ml（溶于DPBS）適合用于體內(nèi)注射用。按照100-200 μl（1-2 mg） Brdu的量腹腔注射到小鼠體內(nèi)。注意：最短在注射后0.5 h后在小腸，胸腺和骨髓瘤處就能檢測到Brdu。而一般在注射后24 h內(nèi)幾乎所有組織都能檢測到Brdu。這個時間可能對于一些快速分化的組織如小腸來說有些久。
2） 根據(jù)自身的實驗體系，在合適的時間點處死動物，摘除待研究的組織。使用冰凍切片或者石蠟包埋的方法進行組織處理和切片制備。然后進入后續(xù)的IHC染色步驟。

3. 體外Brdu標記（培養(yǎng)原代細胞或者細胞系）
1） 在96孔板上按標準步驟進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)時間一般為1-72 h；
2） Brdu工作液的準備：用組織細胞培養(yǎng)液按照1:30的比例稀釋儲存液得到1mM Brdu工作液。然后取10 μl 1 mM Brdu溶液直接加入1 ml組織培養(yǎng)液即得到最終工作液。37°C溫熱。
3） 按100 μl/孔Brdu工作液的量進行細胞標記，37°C孵育60 min~過夜。同時設置非Brdu標記的細胞作為陰性對照。注意：的孵育時間取決于細胞增殖速度以及需要達到的實驗目的。比如，對于快速增殖細胞（如HL-60）有效孵育時間為30-45min；對于原代細胞（如未受外源刺激培養(yǎng)的外周血淋巴細胞）孵育時間可能需要24 h。細胞密度不要超過2x106 cells/ml。
4） 制備單細胞層玻片。
5） 將玻片置于70%冰乙醇放在-20°C下固定20-30 min。
6） PBS清洗細胞3次，每次5min。
7） 加入1.5M HCl中室溫孵育30 min。
8） 吸去HCl，PBS清洗2次，每次5min。
9） 進入后續(xù)ICC染色步驟。

4. 體外Brdu標記（組織薄片）
1） Brdu工作液的準備：用組織細胞培養(yǎng)液按照1:30的比例稀釋儲存液得到1mM Brdu工作液。然后取10 -20 μl 1 mM Brdu溶液直接加入1 ml組織培養(yǎng)液即得到最終工作液。確保有足夠的工作液（37°C溫熱）浸泡組織。
2） 用或者鋒利的刀片將組織切割成約1 mm厚，2 mm2大小的薄片。建議在溫熱的培養(yǎng)基內(nèi)進行切片，利于維持組織的活力。
3） 轉移組織薄片至預裝有10 ml Brdu標記液的15 ml離心管內(nèi)。于37°，CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育需要的時間。孵育時間可變，取決于組織薄片類型以及需要達到的實驗目的（常用的為2-4 h）。直接丟棄未用完的標記液。
4） 37°C PBS清洗組織薄片，每次5 min。
5） 使用標準的冰凍切片或者石蠟包埋切片的方法固定組織。